實驗室化學(xué)分析標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用生物藥物分析法（光譜法、色譜法與面議分析法）測定生物樣品中的藥物濃度時，都必須同時作標(biāo)準(zhǔn)曲線。盡管各種分析方法涉及的原理和方法技術(shù)有所不同，但標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法卻又共同的相似之處，如一般均采用空白生物基質(zhì)中加入定量的藥物標(biāo)準(zhǔn)品混勻，配制成藥濃已知的標(biāo)準(zhǔn)生物樣品，然后與樣品同時測定，zui后用標(biāo)準(zhǔn)藥濃對響應(yīng)值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。此外，生物藥物分析還常常面臨測定體液和器官（或組織）兩類性質(zhì)不同的樣品，因此下面分別針對性的進(jìn)行介紹

一  體液樣品（標(biāo)準(zhǔn)曲線制備）

體液樣品以血漿、血清為zui常用，下面以血清樣品為代表（并以苯妥英血清藥濃為例），說明體液樣品測定時標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法。

苯妥英的有效血藥濃度為10-20mg/L(即10-20ug/ml），標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度應(yīng)涵蓋此范圍，測定時采用內(nèi)標(biāo)法（卡馬西平為內(nèi)標(biāo)）

1. 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

苯妥英標(biāo)準(zhǔn)溶液（貯備液）的配制，精密稱取苯妥英標(biāo)準(zhǔn)品20mg，用0.1mol/l NaOH液溶解后定量轉(zhuǎn)移100ml容量瓶中，然后用蒸餾水溶解后同法定容成100ml。然后將配置的貯備液（含苯妥英0.2g/l，即20ug/100ul）置冰箱內(nèi)4℃保存。

1. 內(nèi)標(biāo)（卡馬西平）溶液的配制 精密稱取卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)品20mg，用甲醇溶解后定量轉(zhuǎn)移100ml容量瓶中，并加甲醇至刻度，置冰箱內(nèi)4℃保存（含內(nèi)標(biāo)0.2g/l,即20ug/100ul）

說明：

對藥物純度的要求:目前很多藥物尚無標(biāo)準(zhǔn)品供應(yīng)，由于生物藥物分析允許的誤差稍寬，因此一般可使用符合藥典標(biāo)準(zhǔn)的原料藥物作為標(biāo)準(zhǔn)品。藥典規(guī)定原料藥物含量一般在98%以上，只要按藥典規(guī)定方法干燥后，即可供配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。對于其他含量規(guī)定較低的藥物或從制劑中提取出來的藥物，則需要經(jīng)測定含量后，按實際含量配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液

對內(nèi)標(biāo)純度的要求：與被測藥物一樣，通常內(nèi)標(biāo)也無標(biāo)準(zhǔn)品供應(yīng)。用內(nèi)標(biāo)法定量時要求同一批樣品中（標(biāo)準(zhǔn)曲線各管與樣品各管）加入想等量的內(nèi)標(biāo)，而無需確知加入內(nèi)標(biāo)的準(zhǔn)確量（因內(nèi)標(biāo)量不參與計算），不可求內(nèi)標(biāo)具有高純度與高含量，但要求齊化學(xué)組成恒定，試用期內(nèi)穩(wěn)定，并且不含干擾自身和被測組分（藥物與待測物）等色譜峰的雜質(zhì)，這是對內(nèi)標(biāo)純度的基本要求。在實際工作中，常常遇到某藥物為合適的內(nèi)標(biāo)，卻無原料藥物可供使用的情況，此時可從該藥物的只制劑中提取，并適當(dāng)精處理，只要無干擾分析的雜質(zhì)村子，組成穩(wěn)定，即可供作內(nèi)保使用

標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬用5個濃度點，稀釋時取潔凈、干燥的試管5支，分別編號為a b c d e 然后按下圖方法稀釋，使每管稀釋液中含苯妥英濃度分別為5.0、40.、2.5、2.0、1.0（ug/100ul）

說明：

為方便快速稀釋，應(yīng)使用帶可更換塑料尖頭的定量移液管（微量取樣器）

倍數(shù)稀釋的原理：銀兩種水溶液混合時不會發(fā)生所容顯現(xiàn)，因此當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積苦熬大若干倍時，則藥濃降低相同倍數(shù)。所以可將濃貯備液或以稀釋后的貯備液按一定倍數(shù)比稀釋，得到所要求的藥物濃度，如于a管中先加入100ul貯備液（20ug/100ul）,軟后再加入300ul蒸餾水混勻，則叨叨5ug/100ul的稀釋液，又如于C管中加入200ul以稀釋好的a管內(nèi)溶液（5ug/100ul)，然后加入200ul蒸餾水混勻，記得到2.5ug/100ul的稀釋液。稀釋時為確保準(zhǔn)確的倍數(shù)比關(guān)系注意一下幾點

a、應(yīng)使用干燥試管。

b、醫(yī)用同一支定量移液管吸取帶混合的兩種液體（藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液和蒸餾水）,如此可避免移液管體積不準(zhǔn)引入的誤差。例如，試管a內(nèi)的稀釋：可用同一支100ul的移液管，先加入100ul貯備液（20ug/100ul），加入蒸餾水3次（100ul*3），混勻后得到5.0ug/100ul的溶液:蒸餾水的加入改用另一只大號移液管一次加入300u.l，則可能由于移液管本身體積的準(zhǔn)確性使兩次加液體積比偏離（1:3）而引入倍數(shù)比誤差。

c、溶解藥物標(biāo)準(zhǔn)的溶劑硬件量用蒸餾水（或稀酸，堿溶液），引用蒸餾水稀釋時不會發(fā)生縮容現(xiàn)象，只有不溶于水的藥物，才能考慮使用甲醇或乙醇溶解。

   配置藥物標(biāo)準(zhǔn)血清濃度時沒分空白血清中擬加入100ul藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋液，  因此上表第二欄 欲稀釋的藥物濃度以ug/100ul計。當(dāng)然表中沒分空白血清中加入的藥物稀釋液體積也可改為（50ul)時體積的準(zhǔn)確度稍差，二加入大體積優(yōu)惠增大許晴樣品預(yù)處理的體積 ，因此習(xí)慣上以加入100ul較為適宜。

   上表是先弄配藥物標(biāo)準(zhǔn)品貯備液（冰箱保存）臨用時取少部分放至是問候在采用倍數(shù)稀釋法  使成所需濃度，其優(yōu)點是貯備液長期保持冷貯并且開平次數(shù)少，可保持藥物及 其濃度的穩(wěn)定，有趣事甲醇或乙醇配置時，多次開屏使其濃度發(fā)生改變，當(dāng)然若經(jīng)試驗證明吳穎賢，一顆照此法配成目標(biāo)濃度后使用。

因沒分樣品中擬加入內(nèi)標(biāo)（卡馬西平）溶液100ul，配制濃度也用 ug/100ul標(biāo)示。上面的介紹的方法是直接將卡馬西平賠償目標(biāo)濃度，實際工作中可濃配后貯存，臨用時再行稀釋。

上表中zui后一欄各管內(nèi)溶液體積，系全部稀釋完畢后個管內(nèi)溶液的試劑體積。配置血清藥物標(biāo)準(zhǔn)濃度時見下表，自上表沒觀眾吸取100ul，為保證有足量供吸取，因此個管內(nèi)的溶液應(yīng)多于100ul。

藥物血清標(biāo)準(zhǔn)濃度的配制

制備標(biāo)準(zhǔn)曲線時，需用抑制藥濃的血清標(biāo)準(zhǔn)樣品，通常是現(xiàn)將苯妥英標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成抑制濃度，然后取一定體積加入到空白血清中混勻，得到藥物血清標(biāo)準(zhǔn)濃度，配制時可照上表對應(yīng)的苯妥英稀釋液100ul，即A管中加入a液（5.0ug/100ul）、B管中加入b液（4.0ug/100ul）、C管中加入c液（2.5ug/100ul）·····一次類推，S代表供測樣品管，內(nèi)城血清樣品0.2ml，補(bǔ)加蒸餾水100ul，使與標(biāo)準(zhǔn)曲線各罐體及一致（均為0.3ml）。雖然此時體積均一致，但各管血清量實為0.2ml，因此認(rèn)為管內(nèi)的藥物量系0.2ml血清所含，換算成每ml計的血清藥物濃度分別為下表所示，

說明：

因為測定時擬用0.2ml血清樣品，因此標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)加入空白血清量為1.2ml。測定時許晴樣品的去用量，應(yīng)根據(jù)樣品實際含藥濃高低和測定方法靈敏度而定，含藥濃高者，許晴樣品用量可減少，具體取樣量應(yīng)通過試驗確定，但無亂取樣量多少，標(biāo)準(zhǔn)曲線各管中加入的空白恤清涼英語樣品測定一致

上表中勒出1份樣品（S管）,實際測定時樣品數(shù)量較多。為使操作方便，可將樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線鎘濃度的編號，預(yù)先寫在小塊膠布條上，再將膠布條貼在是觀賞，當(dāng)樣品管依照下表末欄補(bǔ)加蒸餾水之后，一下各管的預(yù)處理操作*相同，而預(yù)處理個步驟中常設(shè)計溶液的轉(zhuǎn)移，須更換試管，當(dāng)試管內(nèi)溶液轉(zhuǎn)入另一試管后，可將其上的膠布去下，隨即轉(zhuǎn)貼于新歡的是觀賞，如此有條不紊的驚醒預(yù)處理，可加快操作速度，保證與處理完畢后各管內(nèi)容物對應(yīng)于元血清樣品或標(biāo)準(zhǔn)曲線各管。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與樣品分析

上表配置好苯妥英個許晴標(biāo)準(zhǔn)濃度，并將個許晴樣品補(bǔ)加100ul蒸餾水后于個觀眾分別加入內(nèi)標(biāo)溶液100ul（含20ul卡馬西平）,混勻后加入0.2ml磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L,ph7.5)及乙酸乙酯1.5ml，置旋渦混合發(fā)生器上萃取10分鐘后離心（200-2500r/min）。吸取上清液1.2ml入尖底試管，并將試管置于水浴中（35-40℃）通過壓縮空氣揮干，殘渣用30ul流動相重組，進(jìn)樣20ul左色譜檢測，用色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)記錄苯妥英和內(nèi)標(biāo)的峰高，并計算出各分樣品（血清樣品及標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度）的峰高比（苯妥英/內(nèi)標(biāo)），現(xiàn)以某次測定數(shù)據(jù)為例，測得的數(shù)據(jù)及處理見表14-4，以峰高比對苯妥英血清標(biāo)準(zhǔn)濃度作圖，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見下表。

說明：

血清樣品中苯妥英濃度球閥：由14-3中待測血清樣品（S管）的峰高比（0./861），可直接沖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查的血清樣品中苯妥英的濃度，也可將峰高比帶入回歸方程式計算后求得。

器官、組織樣品

器官、組織系半固體裝樣品，因此標(biāo)準(zhǔn)曲線制備與楊平測定方法有別于體液樣品，下面一動物肝臟內(nèi)藥物分布量測定為例，賈少標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法、樣品測定以及藥物分布量計算方法。

1、用同種空白基質(zhì)加藥物標(biāo)準(zhǔn)品制備標(biāo)準(zhǔn)曲線

測定動物肝臟內(nèi)藥物分布量時，可另取健康動物肝臟，按照制備樣品肝勻漿相同方法作成空白肝勻漿。標(biāo)準(zhǔn)曲線制備時，扔參照前面提到的方法，知識用空白肝勻漿代替表中第3欄的空白許晴，尹云江的粘稠度與勻漿制備時外加的溶液里量多少有關(guān)，若加入量較少，則勻漿較粘稠，則取量可改用體積計，若加入量較少，則勻漿粘稠，則取量可改用重量，此時標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)改為單位重量重要濃度。參照以上圖標(biāo)A-E標(biāo)準(zhǔn)曲線各管中加入的空白肝勻漿量，亦是根據(jù)樣品分析時需要的肝勻漿量二區(qū)訂單的，（應(yīng)與其等量），當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線個觀眾加入空白肝勻漿與樣品管中加入被測肝勻漿后，再按表14-2中第五欄和第六欄方法，于標(biāo)準(zhǔn)曲線個觀眾加入藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋液100ul，于樣品管中加入等量的內(nèi)標(biāo)溶液混勻，取經(jīng)過預(yù)處理后的溶液進(jìn)行分析，一標(biāo)準(zhǔn)曲線各管得到的藥物色譜峰響應(yīng)值，或藥物與內(nèi)標(biāo)色譜峰響應(yīng)值之比（內(nèi)標(biāo)法）對標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品肝勻漿中的藥物濃度，可由金陽后獲得的藥物峰響應(yīng)值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得。

從上面標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到的樣品勻漿中藥物的濃度（ug/ml或ug/g），做勻漿前可先稱定肝臟重量，做勻漿時記錄加入生理鹽水或其他溶液后的體積或重量，然后在制成勻漿，由此可知勻漿體積或重量與肝組織種之間的換算關(guān)系。當(dāng)測定出勻漿中的藥物濃度后，便可換算成單位重量肝組織中韓藥量，進(jìn)而得到整治肝臟內(nèi)的韓藥量。用藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣簡歷標(biāo)準(zhǔn)曲線（共樣品*提取定容后測定用）

與藥物濃度測定相比，測定器官、組織中藥物的分布量時，需分析的樣品數(shù)量相對較少，并且不要求快速提供結(jié)果，因此可將藥物自生物材料中全部提取盡后定容，然后進(jìn)行分析，直接沖標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到對應(yīng)的藥物濃度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備  可將藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液準(zhǔn)確稀釋成4-5中濃度，然后自各濃度稀釋液取相同體積進(jìn)樣，記錄藥物色譜峰響應(yīng)值（峰高或峰面積），以藥物色譜峰響應(yīng)值對藥物敬仰量（20ul內(nèi)所含藥物量）作圖，級的標(biāo)準(zhǔn)曲線。此外也可曲線同一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行4-5次，每次進(jìn)樣不同體積，同上以藥物色譜峰響應(yīng)值對藥物進(jìn)樣量（進(jìn)樣體積內(nèi)所含藥物量）左標(biāo)準(zhǔn)曲線，上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的藥物量范圍，英語贗品分析先適應(yīng)，即覆蓋樣品處理后進(jìn)樣溶液內(nèi)的藥物量。

藥物的*提取預(yù)定量 現(xiàn)將氣管，組織樣品照前述方法做成勻漿，然后準(zhǔn)確取一定量置于試管中，加入緩沖液后用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑漩渦混合萃取，林夕后分出有機(jī)溶劑層，如此反復(fù)萃取4-5次，直至將藥物萃取盡。將各次離心后分出的有幾層合并，定容后供進(jìn)樣分析，若進(jìn)樣分析后發(fā)現(xiàn)有干擾雜質(zhì)，可將有機(jī)層用另一種緩沖液再行多次反萃，使藥物定量轉(zhuǎn)入水層，水層合并后定容，供進(jìn)樣分析，由進(jìn)樣后得到的藥物色譜峰響應(yīng)值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查的對應(yīng)的腰五糧，再根據(jù)進(jìn)樣體積與提取液定容體積。換算成提取液中的藥物量，此即為取量勻漿中含有的腰五糧，然后再換算成原器官，組織含藥物量、

為確定勻漿中的藥物萃取*需要的條件，可將定量的藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入空白勻漿中混勻然后再行萃取，以藥物能全部定量回收作為判斷指標(biāo)，由此確定萃取時合適的溶劑種類、萃取次數(shù)、溶液PH,以及樣品是否需要蛋白處理等必要條件。